Fou un centre dedicat als estudis humanistes, a les llengües clàssiques, a l’hebreu i a la crítica filològica. Des de la fundació tingué facultats de teologia, filosofia, dret canònic i medicina. Una de les obres més importants de la universitat fou la impressió de la Biblia Políglota Complutense (1517). La competència dels col·legis de jesuïtes durant el s XVI, i la dels estudis de San Isidoro de Madrid fundats l’any 1625, motivaren l’inici del procés de decadència. El regalisme hi provocà la introducció dels jesuïtes (1667), i l’atorgament, anys després, d’una facultat de dret civil (1672). Suprimida durant el trienni liberal (1821-23) arran de la creació de la Universitat de Madrid, el 1824 reprengué l’activitat, mutilada, però, dels estudis de medicina. L’any 1836 hom disposà el trasllat definitiu a Madrid; encara conservà durant un any a Alcalá les facultats de lleis i de cànons.