Fill d’un humil blanquer, feu estudis a Arbois, a Besançon i a París (a l’École Normale i a la Sorbona). Doctorat en ciències (1847), ensenyà física i química a Dijon, Estrasburg (on es casà i continuà els seus primers treballs sobre dissimetria molecular) i Lilla. L’any 1857 fou nomenat administrador de l’École Normale Supérieure, i des d’aleshores residí a París, llevat d’alguns viatges que feu per l’Estat francès (principalment a Arbois, Alais i Pont-Gisquet) a fi d’estudiar científicament la fabricació del vi i les malalties del cuc de seda. El 1873 començà a investigar les malalties infeccioses humanes, especialment el carboncle i la ràbia. El seu rebatiment de la teoria de la generació espontània, així com els seus estudis sobre la fermentació (alcohòlica i làctia) i les noves tècniques de conservació de la llet (pasteurització), ja l’havien donat a conèixer dins el món científic. L’èxit de les primeres vacunacions antiràbiques el feren famós arreu del món, i la seva teoria microbiana, acceptada per tothom, inspirà mesures d’asèpsia i antisèpsia que salvaren moltes vides. L’institut d’investigacions, que fou inaugurat sota el seu patrocini (1888) i que porta el seu nom, ha estat —i és encara— un centre d’ensenyament, investigació i elaboració de sèrums i vacunes d’utilitat mundial. L’obra escrita per Pasteur fou aplegada i publicada íntegrament pel seu net Louis Pasteur Vallery-Radot, i aparegué a París amb el títol d'Oeuvres complètes (1924-39), en set volums.