Fou iniciat al s XVIII amb el Museo Sacro, fundat per Benet XIV (1756), dedicat a l’antiguitat cristiana i al primitiu art litúrgic, i el Museo Profano, obra de Climent XIII (1767), dedicat a monedes, medalles, camafeus i objectes de vori: ambdós foren instal·lats sumptuosament a la galeria de la Biblioteca Apostolica Vaticana. Fou, però, Climent XIV (1770-74) qui inicià la gran empresa museística vaticana: transformà en museu, i l’amplià amb una nova galeria, el palau del Belvedere d’Innocenci VII, i hi instal·là les col·leccions d’escultura antiga iniciades per Juli II (1503-13): el museu s’anomena Museo Pio-Clementino, per tal com fou ampliat i enllestit per Pius VI (1775-99). Entre altres tresors, s’hi exhibeixen l'Apol·lo del Belvedere i el grup Laocoont (de la collecció de Juli II), l'Apoxiòmenos de Lisip i els busts d’Homer, Pèricles, Sòcrates i Plató. Pius VII (1800-23) hi afegí la galeria septentrional, seu de l’anomenat Museo Chiramonti e Braccio Nuovo, que, entre altres escultures, conserva la de Demòstenes i la d'August de Prima Porta. Al costat del Pio-Clementino Gregori XVI fundà el Museo Gregoriano Etrusco (1837), que, entre altres tresors, conserva els objectes provinents de la necròpoli etrusca de Cerveteri, el Mart de Todi, bronzes i objectes d’orfebreria i de terrissa, i el Museo Gregoriano Egizio (1839), que conserva nombroses mòmies i estàtues egípcies. Pius XI féu construir l’actual entrada als museus i l’edifici de la Pinacoteca Vaticana (1932), que conserva pintures de Fra Angelico, Rafael, Leonardo da Vinci, Ticià i Caravaggio (l’any 1973 Pau VI hi afegí la Collezione d’Arte Religiosa Moderna, que aplega l’obra de més de 200 artistes actuals). Al costat d’aquest edifici Pau VI (1970-73) obrí al públic la nova instal·lació dels antics museus del Laterà: el Museo Gregoriano Profano (creat el 1843 per Gregori XVI), que conserva diverses escultures romanes provinents dels Estats Pontificis, un bust de Sòfocles i el grup d’Atena i Màrsies de Miró, el Museo Pio Cristiano (creat el 1854 per Pius IX), on s’apleguen nombroses inscripcions gregues i llatines de les basíliques i les catacumbes, una estàtua del Bon Pastor, mosaics paleocristians i medievals i una important col·lecció de sarcòfags, i, finalment, el Museo Missionario Etnologico (fundat per Pius XI l’any 1926), que conserva importants colleccions etnològiques d’arreu del món. Dins el recorregut dels museus hom pot visitar també diverses capelles, sales i galeries adornades amb frescs, entre les quals es destaquen la Capella del Beato Angelico, amb frescs de Fra Angelico, sota Nicolau V (1448-50), la Capella Sixtina, els apartaments d’Alexandre VI (estances Borja), decorats per Pinturicchio (1492-94), la Capella d’Urbà VIII (1625-44), les estances de Rafael, etc. Joan Pau II inaugurà al febrer del 2000 els nous accessos i serveis d’acollida als visitants dels Musei Vaticani inspirats en l’entrada del museu del Louvre de París. Aquest nou accés té com a objectiu fer més àgil l’entrada a les galeries dels tres milions de visitants que anualment rep el museu. L’entrada de la plaça del Ressorgiment condueix el visitant a un atri de 10 000 m2, que té una capacitat per a 2 000 persones. En aquest primer nivell hi ha les taquilles per a grups organitzats i altres serveis d’atenció al visitant. Les taquilles generals es troben en un altre nivell. Les obres suposaren també la creació d’àrees de descans, una sala per a exposicions temporals i una terrassa per a mostres a l’aire lliure.