Rebé una bona educació clàssica, sota la direcció del seu oncle, Giorgio Antonio Vespucci, dominicà i humanista, alhora que un altre oncle, Guido Antonio Vespucci, polític i diplomàtic, l’inicià en els negocis públics. En 1478-80 acompanyà a París el seu oncle Guido, aleshores ambaixador de Florència a França, en qualitat de secretari. El 1484 passà al servei dels Mèdici, i el banquer Lorenzo Pier Francesco de Mèdici li confià els seus negocis com a administrador-comerciant. Durant aquest període, com a agent dels Mèdici, els afers mercantils el portaren (1492) a Sevilla, a la casa del banquer Gianotto Berardi, on residí fins a la mort d’aquest (1495). Col·laborà en la provisió i el noli dels vaixells enviats a les Índies, i també participà en l’avituallament de la tercera expedició de Cristòfor Colom. Influït potser per l’esperit d’aventura, a partir del 1497 s’inicià en la navegació. Bé que els seus viatges són molt discutits, segons la seva obra Lettera di Amerigo Vespucci delle isole nuovamente trovate in quatro suoi viaggi en féu quatre. El primer sembla que fou el 1497; en aquest formà part de l’expedició que aleshores comandà Juan Díaz de Solís i que sortí de Cadis el 10 de maig; els expedicionaris feren escala a les Canàries i posteriorment arribaren a la mar de les Antilles, probablement fins a l’actual Costa Rica, vorejaren la península del Yucatán, recorregueren el golf de Mèxic i remuntaren la Florida, fins a la badia de Chesapeake, i tornaren a la península Ibèrica per l’octubre del 1498. El segon viatge fou efectuat en 1499-1500; aquesta vegada era comandat per Alonso de Ojeda, amb la participació de Juan de la Cosa; l’expedició sortí del Puerto de Santa María el 18 de maig, vorejà Trinitat, Margarita, costa de Las Perlas, Curaçao i la península de la Guajira, i acabà a la Hispaniola; els expedicionaris tornaren a la península Ibèrica pel juny del 1500. L’any 1501 Vespucci passà al servei del rei Manuel de Portugal, i féu el seu tercer viatge; l’expedició lusitana fou comandada pel portuguès Gonçalo Coelho, i es dirigí al Brasil; la tornada a Lisboa es produí pel setembre del 1502. L’últim viatge, efectuat en 1503-04, també sota bandera portuguesa, sembla que tenia una doble finalitat: de l’una banda, es tractava de trobar un pas cap a l’Índia, i de l’altra, d’intentar d’arribar al país de les espècies, ocupar el territori, colonitzar-lo i establir-hi una factoria. Vespucci arribà aleshores fins al Brasil, i recorregué una part de la costa brasilera, fins a São Vicente, i pel juny del 1504 tornà a Lisboa. Cap a l’any 1505 tornà a Castella, on tingué ocasió d’entrevistar-se amb Colom, i poc temps després el rei Ferran II el cridà a la cort. El 24 d’abril del mateix 1505 aconseguí la naturalització als regnes de Castella i Lleó, i gaudí del títol i el sou de capità, fins el 1508, que el monarca castellà el nomenà piloto mayor de la Casa de Contratación, càrrec que exercí fins a la mort. D’ell prengué nom el nou continent, Amèrica.