Fundat l’any 1916 com a Museu Arqueològic Diocesà de Barcelona a iniciativa del bisbe Enric Reig , tingué els precedents en la creació dels museus diocesans de Vic, Lleida i Solsona i la celebració del Primer Congrés d’Art Cristià de Catalunya (1913). Fins a la seva mort (1976) en fou el primer director Manuel Trens, i el primer emplaçament fou la planta baixa del seminari conciliar. Durant la Guerra Civil Espanyola fou saquejat i algunes de les peces destruïdes, entre les quals cal esmentar el retaule de Sant Silvestre de Sant Sebastià de Montmajor.
Reobert el 1960, recuperà part de les obres perdudes i el 1982 es traslladà definitivament a la seu actual, l’edifici de la Pia Almoina, annex a la catedral de Barcelona. A part de les obres pròpies, en col·laboració amb altres institucions culturals i de la ciutat du a terme també regularment exposicions temporals.
El fons del museu (unes 2.000 obres catalogades al final de la primera dècada del segle XXI) és constituït sobretot per peces procedents del territori de l’arquebisbat de Barcelona i comprèn des d’obres tardoromanes i preromàniques fins a l’art de començament del segle XX anterior a les avantguardes. El Museu ha rebut també nombroses donacions procedents de col·leccions particulars.
El romànic és molt ben representat per, entre altres, les pintures al fresc de Sant Salvador de Polinyà, la talla del Crist en Majestat o diverses talles de la Mare de Déu, com la de Toudell, del segle XIII, o la Creu Processional de Riells del Fai.
Del gòtic, també destacat, hi figuren els retaules de mestres catalans com els Bassa, Jaume Huguet, Bernat Martorell, etc., així com el sepulcre de fusta policromada de Santa Maria de Cervelló. Del Renaixement sobresurten els retaules de Joan Gascó de Sant Marçal i Sant Sebastià procedents de Sant Pere de Vilamajor, i del barroc pintures d’ Antoni de Viladomat i talles procedents de retaules desapareguts.
Els corrents dels segles XIX i XX (romanticisme, realisme, modernisme, noucentisme) es troben ben representats amb mostres d’artistes catalans (Alexandre de Riquer, Francesc Gimeno, Joaquim Mir, Isidre Nonell, Nicolau Raurich, Agapit Vallmitjana, Pau Gargallo, Josep Llimona i Josep Obiols). Després d'una remodelació de 6 mesos, el Museu Diocesà reobrí el setembre del 2015 amb la inauguració de The Gaudí Exhibition Center, un espai de 1.000m2 dedicat a l'obra d'aquest arquitecte, analitzada amb detall a través de les noves tecnologies (realitat augmentada, mitjans interactius, maquetes digitals, etc.).