El primer document referit a aquest compositor data del 1498, en què el jove Peñalosa fou acceptat com a cantor a la capella musical de Ferran el Catòlic. L’any 1511 fou nomenat mestre de capella de l’infant Ferran d’Aragó. El seu nom continuà en els registres de la casa reial d’Aragó fins el 1516. El seus serveis foren recompensats amb una canongia a la catedral de Sevilla, atorgada el 1517, que no arribà a ocupar i que fou la causa de diversos litigis amb el capítol. Després de la mort de Ferran, marxà a Roma, on s’establí entre el 1517 i el 1525. De retorn a Sevilla, ocupà el càrrec de tresorer de la catedral fins al moment de la seva mort. La major part de la seva música s’ha conservat en manuscrits de procedència aragonesa, fet que fa suposar que es tracta d’obres del seu període al servei de la cort d’Aragó. Se’n coneixen sis misses sobre cantus firmus gregorians o profans, algunes parts de missa aïllades, sis magníficats, diverses lamentacions, himnes i una col·lecció de més de vint motets. També s’han conservat una quarantena de peces profanes. De tots els compositors hispànics de la seva època, Peñalosa fou, sense dubte, el més brillant i el més flexible a l’assimilació dels procediments tècnics i estilístics de la generació de Josquin Des Prés.