La seva obra representa la culminació de l’art de l’edat mitjana i alhora la iniciació de la pintura renaixentista. Visqué a la Haia (1422-24), a la cort de Joan de Baviera, comte d’Holanda. El 1425 s’instal·là a Bruges, cridat per Felip III, duc de Borgonya, per a qui treballà com a pintor de cort i per a qui feu diverses missions; una d’elles fou un viatge a Portugal per pintar dos retrats de la princesa Isabel, filla de Joan I. Feu també un retrat, acabat el 1439, de la seva muller, Margaretha (Groeningemuseum de Bruges). La primera manifestació de la seva pintura són unes miniatures realitzades entre el 1420 i el 1425, de les quals només es conserven El naixement de sant Joan Baptista i la Missa de difunts, a Torí. D’aquesta època són també les dues taules de la Crucifixió i del Judici Universal (Metropolitan Museum, de Nova York). El 1432 fou inaugurat el políptic de L'anyell místic (catedral de Sant Bavó a Gant), obra que, segons una inscripció del marc, actualment considerada falsa, sembla que fou començada per Hubert van Eyck, germà de Jan, de qui hom no té gairebé cap notícia i sobre l’existència del qual els investigadors no s’han posat encara d’acord. A la part superior de les portes del políptic hi ha l’Anunciació i, a la inferior, els dos Joans (Baptista i Evangelista), que tenen a banda i banda el matrimoni de Jodocus Vijd, els donants de l’obra. A la taula central, a la part inferior, hi ha el nucli del retaule: l'Adoració de l’Anyell Místic, i a la superior hi ha les figures de Déu Pare i les d’Adam i Eva. El 1433 acabà L’home del turbant, i el 1434 El matrimoni Arnolfini, retrat de dos rics italians instal·lats a Bruges (ambdues a la National Gallery de Londres). Totes aquestes obres són ja alliberades dels convencionalismes gòtics de les miniatures; són l’afirmació i la conquesta de valors ambientals, de la llum i de l’atmosfera. Qualsevol detall hi pren vida pròpia, però mai no trenca la unitat del conjunt ni l’harmonia dels colors a l’oli, la invenció dels quals hom li ha atribuït. Entre les seves altres obres —n'hi ha unes quaranta de conegudes—, cal esmentar La crucifixió (Galleria Franchetti, Venècia), El Crist a la creu (Staatliches Museum de Berlín), La Mare de Déu del canceller Rolin (Musée du Louvre), La Mare de Déu del canonge Van der Paele (Groeningemuseum de Bruges) i La Font de la Vida (Museo del Prado). Les seves obres, moltes de les quals presenten la inscripció als ik kan (‘com puc’), tingueren gran influència en la pintura del s XV i àdhuc del s XVI; Rogier van der Weyden, Petrus Christus, Lluís Dalmau, Antonello da Messina, Conrad Witz i Lukas Moser són els principals seguidors del mestre flamenc.