Actua com a biblioteca central. Iniciada pròpiament després del cisma d’Avinyó, vers el 1376, l’actual biblioteca deriva, tanmateix, de la fundada per Nicolau V (1447-75). Una gran part de la tasca de catalogació i ordenació fou feta en temps de Pius XI. Disposa d’adquisicions i llegats importants, com els dels ducs d’Urbino (1657), de la reina Cristina de Suècia (1690), dels Ottoboni (1748) i dels Borghese (1891), i les col·leccions Barberini (1902), Chigi (1923), etc. Formen el seu fons (1998) uns 75 000 manuscrits, 100 000 gravats, 8 000 incunables i un milió d’altres volums. Conserva manuscrits dels s. IV i V d’obres de Virgili, Ciceró, etc, i autògrafs de Tomàs d’Aquino, Petrarca, Miquel Àngel, Luter, etc. La col·lecció de la Capella Sixtina és d’una gran utilitat per als historiadors de la música. Conserva, a més, una abundant documentació catalana, especialment manuscrits, texts lul·lians, i el Cançoner Provençal A.