Formada (1524) per les llibreries de Cosimo, Lorenzo i Pietro de Mèdici i amb l’ajuda dels humanistes Angelo Poliziano, Pico della Mirandola i el grec Làscaris. Climent VII l’obrí al públic (1532) i encarregà a Miquel Àngel la construcció de l’edifici per a allotjar-la. El seu fons més ric és el de manuscrits grecs i llatins (més de 13 000 dels segles V al XIX). Cal destacar, entre els més valuosos, un Virgili dels segles V o VI, les Pandectes de Justinià (segle VI), un manuscrit únic de les Històries de Tàcit (segle XI), un Homer (segle X), un Decameró, etc. Conté, també, col·leccions de manuscrits procedents dels grans ducs de Lorena, de l’església de la Santa Creu i Sant Marc, de l’abadia de Fiesole, de la catedral de Florència i d’algunes famílies particulars.