Fill dels reis de Castella, l’arxiduc d’Àustria Felip el Bell i Joana la Boja (hereva, alhora, de la corona catalanoaragonesa). A la mort del seu pare (1506), heretà els territoris del ducat de Borgonya —exclòs el ducat pròpiament dit, en poder de França des del 1477—, regits fins el 1515 per la seva tia Margarida d’Àustria, que tingué cura de la seva educació. El 1515, declarat major d’edat, prengué el govern de Borgonya i traslladà la cort de Malines a Brussel·les. Els seus consellers principals foren Jean Sauvage, Adrià d’Utrecht i Guillaume de Croy, senyor de Chièvres. El seu avi, Ferran II de Catalunya-Aragó, l’hagué de representar a Castella fins a 25 anys; per tal de reforçar la seva posició davant el seu germà Ferran, que tenia molts d’addictes entre la noblesa castellana i aragonesa, envià a Castella Adrià d’Utrecht. El 1516, a la mort de Ferran II, heretà el govern efectiu de les corones de Castella i de Catalunya-Aragó, jurídicament a mans de la seva mare Joana; féu que el vicecanceller de Catalunya-Aragó Antoni Agustí, amb tot el Consell d’Aragó, s’hi traslladés, i nomenà Alfons d’Aragó, arquebisbe de Saragossa, regent de la corona catalanoaragonesa; aquest nomenament i el del cardenal Cisneros per a Castella havien estat ja decidits per testament de Ferran II. Confirmà per als alts càrrecs d’Itàlia Ramon de Cardona i Hug de Montcada, continuant la política d’atribuir-los a catalans seguida pel seu avi des de la destitució del Gran Capità.
El 1517 emprengué un viatge a Castella, acompanyat dels seus consellers borgonyons i catalanoaragonesos, i celebrà corts a Valladolid (1517-18) sense cap oposició. Més difícil fou la seva entrada a Catalunya-Aragó: a Saragossa (1518) hagué de fer cara, a les corts, als partidaris del seu germà Ferran, i a Barcelona, on reuní també les corts del Principat (1519-20), després de superar diverses qüestions de procediment, hagué de jurar com a comte de Barcelona en nom propi i de la seva mare conjuntament. Establerta la cort a Barcelona, Carles presidí a la catedral una reunió del capítol del Toisó d’Or, en què foren nomenats sis nous membres, dos dels quals de la corona catalanoaragonesa.
Bon punt l’informaren de la mort del seu avi, l’emperador Maximilià I (a conseqüència de la qual heretà les possessions dels Habsburg a Àustria i al Rin), inicià les gestions com a candidat a l’Imperi: intent frustrat de pacte amb Francesc I de França, un dels candidats més poderosos; mobilització dels governs dels seus estats patrimonials de Flandes i d’Àustria; recerca del finançament de la campanya electoral per part dels Fugger; casament de la reina vídua, Germana de Foix, amb el marquès Joan de Brandenburg-Ansbach, cosí germà d’un dels electors. Aconseguida la seva elecció, la notícia el trobà a Barcelona, que esdevingué, així, uns quants mesos, la capital de l’Imperi. Seguint una línia política iniciada per Maximilià I, donà la jurisdicció de fet sobre tots els afers de l’Imperi al consell de Borgonya, en el qual Mercurino Gattinara obtingué el càrrec de gran canceller (manifestà la preeminència borgonyona mantenint sempre el francès com a llengua pròpia). Sense convocar les corts reglamentàries a València, retornà als Països Baixos deixant com a lloctinent al regne de València i al Principat de Catalunya Diego Hurtado de Mendoza, comte de Melito, a Aragó Juan de Lanuza, i a Castella, com a regent, Adrià d’Utrecht, el qual ell havia fet nomenar bisbe de Tortosa (1516) i inquisidor general de Catalunya-Aragó (1517) i de Castella (1518).
Atiada per la situació de desconfiança mútua entre la noblesa i el rei, esclatà a València, poc temps després de la seva partença de Barcelona, la revolta antiaristocràtica de les Germanies (1519-22), que s’estengué al Principat, on fou aviat sufocada (1520), a Aragó, on no reeixí, i a Mallorca (1520-23), que en fou el darrer reducte, mentre que en les Comunitats de Castella (1520-21) es desencadenava la revolta de les ciutats en desacord amb la política reial de sortida d’or de Castella i de provisió de càrrecs a estrangers. Les crisis foren superades gràcies a l’aliança entre el rei i l’aristocràcia latifundista, que incrementà així la seva situació privilegiada: el 1521 l’emperador associà a la regència castellana d’Adrià d’Utrecht dos grans senyors, el conestable de Castella, Íñigo de Velasco, i l’almirall de Castella, Fadrique Enríquez de Cabrera, que aconseguiren de dominar militarment els revoltats, a Castella (1521) i als regnes de València (1522) i de Mallorca (1523).
Mentrestant, Carles, coronat emperador a Aquisgrà, organitzà els seus territoris segons un concepte patrimonial, com a entitats independents governades per llurs pròpies lleis i atentes només als propis interessos, associades, seguint una concepció medieval alhora borgonyona i catalana, només en la persona del monarca. Forçat a abandonar Alemanya, hi deixà organitzat, a la dieta de Worms (1521), un Consell de Regència, en el qual l’autoritat imperial restava més enfortida que a l’època de Maximilià I, i el 1522, pel tractat de Brussel·les, cedí al seu germà Ferran els territoris austríacs després de nomenar-lo representant seu a l’Imperi; a Flandes, nomenà regent la seva tia Margarida d’Àustria i creà com a autoritat suprema el Gran Consell de Malines (1522).
Del 1522 al 1529, durant l’estada de Carles V als regnes de Castella i de Catalunya-Aragó —el 1522 es casà amb Isabel de Portugal—, introduí, sota la iniciativa del gran canceller Mercurino Gattinara, algunes reformes: creà (1523), en substitució de les dues comptadories majors, el Consell de Finances (d'hacienda) segons el model flamenc i en nomenà secretari Francisco de los Cobos; creà també el Consell de la Cambra, adjunt al Consell de Castella, per assessorar el rei en els nomenaments de càrrecs eclesiàstics, judicials i administratius; creà encara (1524) el Consell d’Índies, que organitzà l’administració colonial (virregnats de Nova Espanya [1535] i del Perú [1542]) amb audiències similars a les de la corona catalanoaragonesa. A la mort d’Antoni Agustí (1523), dividí les funcions de vicecanceller de la corona catalanoaragonesa en tres càrrecs, un per al Principat i els regnes de Mallorca i Sardenya, un altre per al de València i un altre per al d’Aragó (divisió que perdurà fins el 1529), i establí el costum de convocar les corts a Montsó per als tres regnes (1528, 1533, 1537, 1542, 1547, 1555), a les quals —igualment com als altres organismes catalans— fou el darrer rei a dirigir-se en català.
Els afers estrangers eren portats personalment per Carles V des de la mort de Guillaume de Croy, assessorat pel Consell d’Estat, els membres més influents del qual eren, a més de Gattinara, Enric de Nassau, Francisco de los Cobos i, per als afers italians, Hug de Montcada; el 1527 creà un Consell Secret, que esdevingué l’òrgan principal del govern imperial. Mentrestant, la rivalitat entre Carles V i Francesc I de França pels ducats de Borgonya i de Milà, heretada dels seus dominis borgonyons i catalans i accentuada per la competència en la candidatura a la corona imperial, havia cristal·litzat amb la invasió francesa del Rosselló i de Navarra i amb les ofensives a Tournai i al nord d’Itàlia, i acabà amb la victòria imperial de Pavia (1525), on Francesc I fou fet presoner i traslladat a Madrid. Pel tractat de Madrid (1526), Francesc I fou alliberat a canvi de renunciar a les seves pretensions a Itàlia i a Flandes i a lliurar Borgonya a Carles. Represa, però, la lluita per la coalició de la lliga de Cognac (1526), culminà amb el saqueig de Roma per part de les tropes imperials (1527), fet que revifà l’esperança dels erasmistes, com Gattinara, de supressió del poder temporal del papa. El 1528, fracassada una temptativa de resoldre la rivalitat entre Carles V i Francesc I amb un duel, els francesos envaïren el Milanesat i posaren setge a Nàpols. El pas d’Andrea Doria amb la seva flota del servei de Francesc I al de Carles V (a partir d’aleshores Gènova suplantà Barcelona com a suport principal de la política mediterrània de l’emperador) facilità la derrota de l’exèrcit francès a Nàpols. Miquel Mai —que ocupà el lloc directiu de la política italiana de Carles V, vacant amb la mort d’Hug de Montcada— gestionà la pau amb Climent VII, la qual fou signada a Barcelona el 1529 (pau de Barcelona); fou signada alhora la pau de Cambrai, per la qual Carles V renunciava Borgonya, i França li reconeixia la sobirania sobre Flandes i Artois i els drets sobre Milà, Gènova i Nàpols.
El 1530 Carles V —les tropes del qual acabaven de frenar els turcs a Viena— fou coronat per Climent VII a Bolonya amb la corona de ferro de Llombardia i la corona imperial, fet que simbolitzava la fi de la república cristiana preconitzada pels erasmistes del seu consell, com a realitat política, i la seva substitució per la idea del vell imperi medieval. L’emperador anà a Augsburg, on, davant l’expansió del protestantisme a Alemanya —després de les revoltes socials dels cavallers (1523) i dels pagesos (1524-25)—, seguí, aconsellat per Nicolas Perrenot, senyor de Granvelle (que juntament amb Francisco de los Cobos ocupà el lloc deixat per la mort de Gattinara —1530—), i pels seus ambaixadors a Roma, Loaisa i Miquel Mai, una política inicial de compromís i de pacificació, palesa a la dieta d'Augsburg (1530). Amb tot, l’acord entre catòlics i protestants es trencà el 1531 amb la formació de la lliga d'Esmalcalda. Carles V confià la solució en la celebració d’un concili general. Davant la creixent amenaça turca, nomenà la seva germana Maria d’Àustria regent dels Països Baixos i féu proclamar el seu germà Ferran rei de romans, i tornà a Barcelona, on preparà, per fer cara a la nova coalició francoturca, la gran expedició, menada personalment per ell, que acabà amb la presa de Tunis (1535). Però França s’apoderà del ducat de Savoia, pèrdua consolidada per la treva de Niça.
El 1539 morí la seva muller Isabel de Portugal, de qui havia tingut Felip, el seu hereu, Maria, que s’havia de casar amb l’emperador Maximilià II, i Joana, que es casà amb Joan, príncep de Portugal; anteriorment (1522) ja havia tingut una filla de Joana van der Gheyst, Margarida d’Àustria, futura governadora dels Països Baixos. Carles, obligat a resoldre els problemes germànics, nomenà regent de Castella el seu fill Felip, que fou qui de fet governà, sobretot des del 1543 (any que fou també reconegut com a regent de Catalunya-Aragó). El 1554, amb motiu del casament de Felip amb la reina d’Anglaterra Maria I, Carles V li donà el regne de Nàpols i el ducat de Milà. Desaparegut Miquel Mai (1546), cap més català no intervingué en la direcció de la política imperial fora de la vicecancelleria catalanoaragonesa. Els organismes catalans de govern s’anaren inhibint de tota política exterior; la creació (1554) del Consell d’Itàlia desmembrant la jurisdicció del Consell d’Aragó establí de dret una situació de fet iniciada vers el 1530. Represa la guerra amb França (1541), mentre els turcs s’apoderaven de Budapest, Francesc I, ajudat per l’esquadra otomana amb base a Niça, es llançà a una ofensiva a gran escala.
L’emperador, després d’una solemne visita a Mallorca i d’una d’imprevista a l’Alguer, fou derrotat a Alger (1541) i hagué d’evacuar el Piemont. Pel tractat de Crêpy (1544), tanmateix, fou reconegut el statu quo ante i pogué afrontar els problemes germànics, per als quals intentà de trobar fórmules de compromís amb els protestants (que repercutiren en les sessions del concili de Trento, 1545-52); amb el seu triomf sobre els protestants a Mühlberg (1547), imposà a la dieta d’Augsburg (1548) la religió de l’Ínterim que feia petites concessions als protestants. Aquests, però, cercaren, en canvi dels bisbats de Metz, Toul i Verdun, l’ajuda d’Enric II de França, i obligaren l’emperador a fugir. Llur victòria fou ratificada pel tractat de Passau (1552) i la pau d'Augsburg (1555), la qual establí el principi cuius regio eius religio, que consolidà el trencament confessional. Després d’un intent, infructuós, de Carles V per recuperar Metz (1554), fou signada la treva de Vaucelles (1556). Durant aquest darrer període tingué un fill de Bàrbara Blomberg (1545), Joan d’Àustria.
El fracàs dels tres objectius fonamentals de la seva política (recuperació de Borgonya, desfeta del poder turc i reconstitució de la unitat religiosa d’Alemanya), les continuades dificultats econòmiques (financerament s’havia hagut de sostenir gairebé exclusivament en els Països Baixos i en les seves posicions italianes: l’or americà no havia començat a arribar d’una manera regular i abundosa fins el 1535, els donatius de la corona catalanoaragonesa havien servit just per a pagar els seus funcionaris reials i ni d’Alemanya ni dels seus estats austríacs patrimonials no havia rebut mai res), el cansament produït per una vida tan agitada (fou tota la vida un rei itinerant) i la mort de Joana la Boja el 1555 (amb la qual cosa adquirí els plens drets a les corones castellana i catalanoaragonesa) el decidiren a abdicar els seus estats i a retirar-se. El 1555 dimití la sobirania del Toisó d’Or i cedí els Països Baixos al seu fill Felip, a qui lliurà també (gener 1556) les corones de Castella i de Catalunya-Aragó. Pel setembre donà l’Imperi al seu germà Ferran, fet ratificat pels electors el 1558, i es retirà a Yuste, on morí.