Estudià medicina a Pisa, però el 1589 abandonà els estudis mèdics i acceptà una plaça de professor de matemàtiques a la mateixa universitat.
Les seves idees, contràries a la física aristotèlica (com és el cas del principi d’inèrcia), i els seus experiments sobre mecànica (velocitat de caiguda dels sòlids, moviment pendular, etc) li ocasionaren tants de retrets dels seus compatriotes, que decidí d’abandonar la Toscana. Refugiat a Venècia, explicà matemàtiques a la Universitat de Pàdua. Assabentat de l’invent de la ullera de llarga vista, ell mateix en construí una i començà l’observació de l’espai. Les seves descobertes (cràters lunars, fases de Venus, satèl·lits de Júpiter, etc), exposades a Sidereus Nuntius, i en unes altres obres posteriors, escamparen la seva fama més enllà dels petits estats italians.
Però la defensa del sistema heliocèntric, aleshores considerat herètic, li ocasionà conflictes amb la inquisició, i l’any 1616 hagué de prometre que abandonaria la tesi copernicana. En ésser elegit papa el seu amic Maffeo Barberini (Urbà VIII), publicà, amb permís de la censura, Dialogo sopra i due massimi sistemi del mondo (1632), obra en la qual tres personatges simbòlics comenten els pros i els contres de les doctrines ptolemaica i copernicana. El fet que els arguments més convincents fossin posats en boca de Salviati, l’apologista de Copèrnic, induí els enemics de Galileu a muntar un aparatós procés amb l’acusació d’heretgia. Fou jutjat pel Sant Ofici i hagué d’abjurar els seus “errors” per tal d’evitar el turment i la foguera. Confinat a Arcetri i quasi cec, escriví Discorsi e dimostrazioni matematiche intorno a due nuove scienze (1638), on, bandejant definitivament la física escolàstica, posà les bases d’una nova mecànica, que acabà d’estructurar Newton.
Galileu fou un innovador teòric i un científic pràctic, a qui hom deu l’invent de la balança hidroestàtica, un sistema per a fixar les coordenades geogràfiques dels vaixells en alta mar, importants perfeccionaments en els telescopis primitius i les idees bàsiques sobre el moviment dels cossos, com també per a mesurar la pressió atmosfèrica i per a construir rellotges de pèndol. Amb Galileu nasqué la ciència moderna, basada en l’observació intel·ligent de la natura, el mètode experimental i la formulació de les teories físiques d’acord amb els fets reals.