Estudià humanitats a Salamanca i a Bolonya, on romangué fins el 1470. Havent tornat a Sevilla, fou familiar del cardenal Alonso Fonseca. El 1475 passà a residir a Salamanca, i fou professor, durant deu anys (1476-86), de la universitat. En aquest període salmantí s’inicià la seva producció literària i publicà una de les seves obres més famoses: les Introductiones in latinam grammaticam, per eumdem recognitae atque exactissime correctae glossematis cum antiquo exemplari collatis (1481; reeditades per Maians el 1773). D’aquesta obra, en les successives reedicions, foren separats alguns apartats que es publicaren com a opuscles independents. Nebrija, a proposta d’Isabel de Castella, la traduí al castellà (1486). Quatre anys després (1490) publicà la Repetitio Secunda quam fecit anno christianae salutis MCCCCLXXXVI de corruptis hispanorum ignorantia quarumdam litterarum vocibus.
Traslladat a Extremadura, a la residència del seu protector, el mestre d’Alcántara Juan de Zúñiga, continuà la seva producció i donà a la llum les obres més interessants: el Vocabularius, constituït per dos diccionaris hispanollatins que comprenien més de cinquanta mil paraules, la Gramática de la lengua castellana (1492) i les Muestras de la historia de las antigüedades de España (1499).
Reintegrat a la universitat salmantina (1505), hi restà durant vuit anys, i se n'acomiadà disgustat perquè no li fou concedida la càtedra de retòrica. Mentrestant havia escrit noves obres, entre les quals les Rerum a Ferdinando et Elisabe Hispaniarum felicissimis regibus gestarum decadas duas, una crònica parcial del regnat dels Reis Catòlics, editada pòstumament el 1545. Cisneros el cridà per ensenyar a la Universitat d’Alcalá, on restà fins a la mort. Corresponen a l’última etapa de la seva vida la famosa Artis rhetoricae compendiosa coaptatio ex Aristotele, Cicerone et Quintiliano, Antonio Nebrissensi concinnotore (1515) i les Reglas de ortografía castellana (1517). Col·laborà també en la revisió i l’edició de la Bíblia complutense i confrontà la Vulgata amb els còdexs grecs. Defensà les seves interpretacions de diversos passatges bíblics (Apología) i comentà gramaticalment passatges de l’Escriptura (Quincuagenas). Cal afegir encara a tota aquesta enorme producció edicions i comentaris dels evangelis, les epístoles de sant Pau, homilies, hagiografies, etc.
Fou, en realitat, un dels pocs humanistes castellans (en el sentit ple de la paraula humanista i en tant que hom el compara amb els altres humanistes europeus). La seva curiositat científica s’estengué, ultra a la filologia i la gramàtica, a camps tan diversos com la història, l’arqueologia, la cosmografia, la botànica, la filosofia i la teologia. Famós per la composició de la seva Gramática en llengua vulgar, es proposà de restaurar l’estudi i l’ús del llatí al seu país (i en això fou un veritable humanista), bé que també defensà que el fet d’haver-la escrita en llengua vulgar afavoria la imposició d’aquesta llengua a d’altres pobles que ell considerava bàrbars. En aquest punt tingué una clara visió de l’imperialisme castellà que s’havia de produir més tard i s’anticipà a la defensa de les llengües “vulgars”, defensa que no trigà gaire a ésser feta també per enaltir l’italià, el portuguès i el francès, als països respectius. Coneixedor de la història de la llengua castellana, ho fou també de la història de la literatura, tant de la culta com de la popular, i, per l’estudi comparatiu que feu entre la llengua llatina i la castellana, arribà a argumentar algunes distincions que, amb el temps, havien d’ésser fonamentals en la ciència de la lingüística.
L’obra de Nebrija als Països Catalans
Les Introductiones... foren editades a Barcelona el 1497 i a València el 1499, i una altra vegada el 1505 a Barcelona, amb els exemples i les correspondències en català, i foren introduïdes com a llibre de text a l’Estudi General el 1508, mentre que el Vocabularius Aelii Antonii Nebrissensis ho fou el 1507, per Gabriel Busa, amb traducció lliure dels termes castellans al català; el 1522 Martí Ivarra hi afegí un lèxic geogràfic. Des d’aleshores les reedicions, sovint ampliades, sovintejaren fins al segle XVIII.