L’intent de Bismarck d’annexionar Slesvig a Prússia i d’excloure Àustria de la Confederació Germànica provocà la guerra (juny del 1866). Lluitaren al costat d’Àustria la majoria dels estats alemanys (Baviera, Saxònia, Baden, Württemberg, Hannover); Prússia s’alià amb Itàlia, desitjosa d’expulsar els austríacs del Vèneto. Les victòries austríaques a Custoza (24 de juny) i el combat naval de Lissa (19 de juliol) enfront dels italians no evitaren l’avanç dels exèrcits prussians, més ben entrenats, i amb un armament superior. Abans que Àustria pogués intervenir, Prússia havia desfet els petits exèrcits de Hannover, de Baviera i de Saxònia i envaïa Bohèmia. L’acció definitiva fou la de Sadová (o de Königrätz), que deixava obert als prussians el camí de Viena (3 de juliol). L’oferta de Napoleó III per a la mediació en les negociacions mogué Bismarck a iniciar converses de pau, pau que fou ratificada a Praga i a Viena amb Prússia i Itàlia, respectivament. Àustria restà completament bandejada d’Alemanya, fou dissolta la Confederació Germànica, i Prússia s’incorporà Hannover, Hessen, el gran ducat de Nassau i la ciutat de Frankfurt, a més dels ducats de Slesvig i Holstein; d’aquesta manera Prússia aconseguia d’unir tots els seus territoris. Àustria perdé el Vèneto, que passà a Itàlia. La derrota influí en la nova forma d’organització de l’imperi d’Àustria, que es convertí en la Monarquia Austrohongaresa (1867).