El primer tipus de microscopi òptic que hom construí, l’anomenat microscopi simple , que no és més que una lupa muntada sobre un suport amb un dispositiu d’il·luminació, és conegut des de mitjan s XV; un dels iniciadors i primer constructor fou Antoni van Leeuwenhoek. Fou probablement cap a la fi del s XVI o cap al començament del s XVII que hom emprengué, a l’encop i a diferents llocs, la realització del microscopi compost , que consisteix, essencialment, en la combinació de dues lents muntades en un tub. No hi ha un acord unànime sobre qui en fou l’inventor; hom n'ha atribuït la invenció a diferents constructors òptics neerlandesos, entre els quals hi ha Zacharias Jansen, Hans Lippershey, Cornelius Drebbel. Robert Hooke destacà per la utilització que en féu. Durant el s XVIII, els avenços del microscopi foren deguts més a milloraments mecànics que no pas a milloraments òptics. Al s XIX, Ernst Abbe formulà la teoria clàssica de la formació d’imatges al microscopi, estudià l’acromatisme i les aberracions geomètriques, i ideà diversos avenços tècnics i teòrics. D’aleshores ençà, el microscopi òptic ha tingut un paper decisiu en el desenvolupament de diverses ciències, especialment en el de la biologia. Els principals elements òptics del microscopi compost són tres lents (o sistemes de lents) convergents, dues de les quals van muntades l’una a cada extrem del tub del microscopi. L' objectiu , que és la lent més important pel que fa a la formació de la imatge, és situat a la banda de l’objecte, i cal que hagi estat corregit de les possibles aberracions geomètriques i cromàtiques; la seva distància focal és molt curta, i forma de l’objecte AB una imatge real A'B' , augmentada i invertida, situada entre la segona lent (l’ocular) i el focus objecte d’aquesta. Hom empra diferents tipus d’objectius segons els resultats desitjats. L' ocular és la lent situada a la banda de l’ull i la seva distància focal és més gran que la de l’objectiu; recull la imatge A'B’ formada per l’objectiu i, treballant com una lupa , l’augmenta tot donant-ne una imatge virtual A'B' . La distància òptica entre l’objectiu i l’ocular és constant i és anomenada longitud del tub . El tub és sostingut pel braç del microscopi (anomenat també columna o estatiu ). Una tercera lent, el condensador , recull la llum fornida pel mirall, làmpada o, en general, per la font de llum , i la concentra puntualment o uniformement sobre l’objecte. Per tal de regular la quantitat de llum que hi arriba hi ha el diafragma entre la font de llum i el condensador. Hi ha també, normalment, un portafiltres , situat entre la font de llum i el diafragma. El dispositiu mecànic que suporta el condensador, el diafragma i el portafiltres és la subplatina . L’objecte a observar, anomenat mostra o preparació , és situat, freqüentment, entre dues laminetes de vidre, la inferior de les quals és el portaobjectes i la superior és el cobreobjectes . El conjunt és situat sobre la plataforma d’observació, anomenada platina . Aquesta pot tenir formes variades (quadrada, rectangular o circular) i és perforada pel centre a fi de deixar passar la llum. Generalment, al damunt hi ha una segona platina, la platina mòbil , que facilita l’exploració de la preparació. A vegades, és graduada o incorpora dispositius que permeten de localitzar amb detall les diferents parts de l’objecte. Completen la platina un sistema de subjecció que manté immòbil la preparació. En el microscopi, l' enfocament consisteix a anar variant la posició relativa entre la mostra i el conjunt òptic fins que la distància entre la imatge virtual fornida per l’ocular, A'B’, i l’ocular, sigui la distància del punt pròxim . Aquesta maniobra d’enfocament permet distingir dos tipus de microscopis: els que presenten un desplaçament del tub mentre la platina roman fixa i els que permeten el desplaçament de la platina mentre el tub resta immòbil. En ambdós casos els moviments són regulats mitjançant dos comandaments: d’una banda, un cargol macromètric , que facilita el moviment ràpid, bé que imprecís, i permet de situar l’enfocament, i, d’una altra banda, un cargol micromètric , que facilita un moviment precís, lent i que ajusta l’enfocament. L' augment del microscopi és la relació entre l’angle amb què es veu la imatge amb l’instrument i l’angle amb què es veuria l’objecte si fos situat a la distància del punt pròxim (que hom pren, convencionalment, com 250 mm) i observat a ull nu. Hom pot demostrar que aquest augment és igual al producte de l’augment lateral de l’objectiu per l’augment angular de l’ocular: G = G o b G o c . Els microscopis disposen, habitualment, d’un tambor giratori, anomenat portaobjectius o revòlver , que porta objectius d’augments diferents, i que té per finalitat d’emprar en cada cas aquell que sigui oportú. A més de l’augment, les característiques òptiques rellevants d’un microscopi són les següents: la distància frontal , l' angle d’obertura , l' obertura numèrica , el poder separador i la profunditat de camp . La distància frontal o distància de treball del microscopi és la distància que hi ha entre la lent inferior de l’objectiu (l’anomenada lent frontal ) fins la preparació; sol variar entre 1 mm i 1 cm. L' angle d’obertura és el format pels raigs extrems que intervenen en la formació de la imatge; és determinat pel diafragma d’obertura de l’objectiu. Hom l’expressa com el doble de l’angle que formen aquests raigs extrems amb l’eix òptic del sistema, és a dir 2α. L' obertura numèrica és el producte de l’índex de refracció del medi (aire o fluid d’immersió) situat entre l’objecte i l’objectiu pel sinus del semiangle d’obertura: ON= n sinα. El poder separador (o poder de resolució lateral ) és la distància mínima r que hi ha entre dos punts de l’objecte les imatges dels quals apareixen separades (resolubles) en la imatge que veu l’observador; és donat per l’expressió r=1,22 λ/2 n sinα, on α és el semiangle d’obertura i λ és la longitud d’ona de la llum emprada per a fer l’observació. La profunditat de camp (o poder de resolució vertical o poder de penetració ) és la distància màxima, mesurada al llarg de l’eix òptic, que hi ha entre dos plans perpendiculars a l’eix òptic tals que tots els plans situats entre ells són observats amb nitidesa un cop fixat un cert enfocament del microscopi; és donada per l’expressió Δx=(λ/4 n )/[1/(1-cosα)), on λ és la longitud d’ona de la llum emprada en l’observació, n és l’índex del medi de l’objecte i α és el semiangle d’obertura. La bona utilització del microscopi és un compromís d’elecció entre augment i poder separador: no sempre és possible d’assolir un gran augment sense que minvi el poder separador. La raó és que l’augment és el producte dels augments de l’objectiu i de l’ocular, mentre que el poder separador depèn de l’obertura numèrica de l’objectiu (els objectius potents tenen, generalment, major obertura numèrica). Així, en un problema concret, no és el mateix emprar un objectiu potent amb un ocular feble que fer-ho a l’inrevés. Cal escollir inicialment l’objectiu que proporcioni el poder separador convenientment per a l’experiència realitzada i, després, cal escollir l’ocular que completi l’augment necessari. L’augment total del microscopi ha d’oscil·lar, preferiblement, entre 500 i 1 000 vegades l’obertura numèrica de l’objectiu. L’augment comprès entre aquests límits és anomenat augment útil . Un augment superior és ineficaç per tal com ja no treu profit de l’obertura numèrica de l’objectiu; hom l’anomena augment buit . Un dels aspectes que més cal tenir en compte a l’hora de fer una observació en un microscopi és la il·luminació de les mostres, que pot fer-se de diferents maneres. Si l’objecte és transparent, hom l’observa per transmissió, és a dir, hom observa la llum que el travessa. El condensador és col·locat de forma que la mostra sigui convenientment il·luminada. Si és situat de manera que forma la imatge de la font lluminosa sobre la mostra, la il·luminació produïda és anomenada il·luminació crítica . L’anomenada il·luminació de Köhler consisteix a regular la posició de la font de llum a fi que la imatge d’aquesta no es formi sobre la mostra sinó en el pla del diafragma del condensador; proporciona una il·luminació uniforme de la mostra. Quan la llum incideix perpendicularment sobre la mostra, els punts d’aquesta apareixen més o menys foscs segons llur opacitat i les parts de la mostra que no contenen cap objecte apareixen clares; aquesta tècnica és anomenada de camp clar . Quan la llum incideix molt oblíquament sobre la mostra, només arriben a l’objectiu del microscopi els raigs dispersats o difractats per l’objecte, que aleshores apareix clar sobre un fons fosc; aquesta tècnica és anomenada de camp fosc . El perfeccionament de la tècnica de camp fosc ha fet possible de distingir objectes de dimensions inferiors al poder separador del microscopi usat, per la qual cosa en aquest mode de funcionament hom parla d' ultramicroscopi . Finalment, quan hom observa un objecte opac, l’observa per reflexió, és a dir, observa la llum que reflecteix. Segons l’angle d’incidència de la llum sobre la mostra, hom parla d’il·luminació de camp clar (quan la llum arriba perpendicularment a la mostra) o d’il·luminació de camp fosc (quan hi arriba oblíquament).
Vista escorxada d’un microscopi òptic binocular [Olympus]
© Fototeca.cat
Molts microscopis són acoblables a cambres fotogràfiques per tal de fer fotomicrografies de les mostres. Hom distingeix els següents tipus principals de microscopi òptic. El microscopi de polarització disposa de dues làmines polaritzadores (o de dos nícols), l’una (el polaritzador ) situada sota la platina (i que, en conseqüència, envia llum polaritzada sobre la mostra) i l’altra (l' analitzador ) situada sota l’objectiu. Quan les làmines estan creuades (és a dir, quan es disposen de manera que llurs plans de polarització són perpendiculars), la llum que travessa les parts transparents de la mostra no arriba a l’objectiu, de manera que el camp apareix fosc llevat d’aquelles zones birefringents o que presenten activitat òptica, és a dir, aquelles amb capacitat de canviar la polarització de la llum que arriba del polaritzador. Generalment, la platina és giratòria a fi i efecte de cercar el millor contrast entre el medi i els objectes de la mostra. Anàlogament, quan les làmines són disposades de manera que tenen paral·lels llurs plans de polarització, el camp apareix clar llevat de les zones birefringents o que presenten activitat òptica. El microscopi de polarització és especialment útil per a estudiar mostres que presenten una estructura ordenada; és emprat en cristal·lografia, metal·lúrgia, biologia i en diagnosi clínica. El microscopi de contrast de fase es basa en el fet que la petita diferència existent entre els índexs de refracció de les diferents parts de la mostra origina retards o avançaments de fase en els raigs que les travessen, retards o avançaments que són transformats (mitjançant un dispositiu adient, que inclou una placa de fase , situada darrere l’objectiu) en diferències d’il·luminació (és a dir, en un contrast) en la imatge. És usat en biologia, especialment quan hom ha d’estudiar preparacions vives, ja que no cal tenyir-les (les tincions no són aconsellades en mostres vives perquè tenen efectes modificatoris i àdhuc letals). El microscopi de contrast interferencial n'és una variant que incorpora tècniques interferencials. El microscopi de fluorescència es basa en la detecció de la fluorescència de l’objecte originada en irradiar-lo amb raigs ultraviolats. Si hom treballés en tota la regió UV, les lents i els portaobjectes haurien d’ésser de quars (ja que el vidre és opac a l’ultraviolat) per raons de costs, hom treballa normalment en l’ultraviolat proper (~350 nm), la qual cosa permet d’emprar òptiques convencionals. Un dispositiu elimina la radiació situada fora de l’espectre visible per tal de protegir els ulls de l’observador. Aquest microscopi és emprat tant per a estudiar substàncies amb fluorescència intrínseca com per a fer-ho amb substàncies tenyides amb colorants fluorescents (anomenats fluorocroms ) que mostren fluorescència tot i ésser presents en ínfimes quantitats (que no afecten mostres vives). Els microscopis binoculars permeten de mirar amb els dos ulls, la qual cosa fa més còmoda i més detallada l’observació i facilita de fer observacions prolongades. Tanmateix, la sensació de relleu és limitada pel fet que hi ha un únic objectiu, després del qual la imatge és separada en dues, cadascuna d’elles dirigida a un ocular diferent. En canvi, en el microscopi estereoscòpic hi ha dos objectius i dos oculars, de manera que les imatges que arriben als ulls són lleugerament diferents (les zones observades són lleugerament desplaçades) i es produeix, en conseqüència, una visió estereoscòpica. Aquest microscopi és emprat per fer disseccions fines. En el microscopi d’infraroigs hom empra radiació infraroja per a il·luminar l’objecte: les imatges obtingudes són transformades en imatges visibles mitjançant un convertidor d’imatge (una pantalla fluorescent, un convertidor electrònic, etc). En el microscopi d’ultraviolats hom il·lumina l’objecte amb radiació ultraviolada, i és especialment útil per a estudiar mostres vives, que normalment són transparents a la llum visible; les imatges obtingudes són fotografiades o visualitzades en una pantalla fluorescent o de TV.