Feu el seu primer vol el 12 d’abril de 1981. L’any 1998, el transbordador Columbia dugué a terme la missió Neurolab, que tenia com a objectiu l’estudi del cervell i del sistema nerviós central. Al transbordador es carregaren 1.514 grills, 223 peixos, 152 rates, 18 ratolins i 135 cargols, els quals serviren per a les primeres disseccions que es feren a l’espai. Diversos experiments estudiaren els efectes de la microgravetat en els primers estadis del desenvolupament, per això hi viatjaven animals de molt poca edat, però molts d’aquests moriren abans que es poguessin fer les proves. Al juliol del 1999, la nau Columbia tornà a enlairar-se des de cap Canaveral per situar en òrbita el Chandra, un observatori de raigs X amb l’objectiu d’obtenir dades sobre la matèria fosca procedent del big-bang i els forats negres. Per primera vegada, la missió fou comandada por una dona, Eileen Colli. L’1 de febrer de 2003 el transbordador Columbia es desintegrà en entrar a l’atmosfera després de dur a terme la seva missió número 28, i els seus set tripulants moriren. Els informes posteriors determinaren que la causa de l’accident fou la caiguda d’un tros de l’aïllant tèrmic dels tancs externs sobre l’ala esquerra del transbordador durant l’enlairament. L’impacte hauria malmès un dels panells que serveix d’escut tèrmic durant la reentrada a l’atmosfera i hauria fet que la temperatura d’aquesta zona de l’ala augmentés fins a provocar-ne el trencament.