Estudià a l’Institut de Tecnologia de Geòrgia i a la Universitat de Califòrnia a Berkeley, on es doctorà el 1972. Després de dur a terme recerca en diverses universitats, l’any 1979 s’incorporà a Cetus Corp., una empresa de biotecnologia on el 1983 desenvolupà la seva aportació principal, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), descobriment que revolucionà la biologia molecular, la biomedicina i la biotecnologia, ja que permet fer un gran nombre de còpies de segments d’ADN de manera ràpida i notablement acurada. Aquesta tècnica ha tingut aplicacions tan diverses com el diagnòstic de malalties de base genètica, la identificació de sospitosos de crims o delictes i de les característiques d’individus fòssils a partir de restes orgàniques, o la seqüenciació del genoma. Del 1986 al 1988 fou director del departament de biologia molecular a l’empresa Xytronyc Inc., a San Diego, i posteriorment treballà com a consultor. El 1993 li fou concedit el premi Nobel de química, juntament amb Michael Smith, pel descobriment de la PCR. En contrast amb el seu vessant científic, fou conegut per diversos posicionaments excèntrics, com ara la creença en visites regulars d’extraterrestres a la Terra, la consideració del canvi climàtic com una conspiració i la negació de l’existència del virus de la sida.