Graduada en economia per la Universitat de Dnipropetrovs’k el 1984, començà treballant en la gestió d’empreses de l’antiga URSS. Amb la independència d’Ucraïna (1991), fou nomenada consellera delegada i posteriorment presidenta de la corporació Sistemes Energètics Units, que gestionava el proveïment i el subministrament d’energia, i aconseguí una gran fortuna. Del 1999 al 2001 ocupà alts càrrecs en el Ministeri d’Energia en el govern de Leonid Kučma, però en fou apartada i empresonada un mes, acusada de corrupció. Convertida en líder de l’oposició, encapçalà juntament amb Viktor Juščenko la campanya de regeneració de la política ucraïnesa, denunciant els abusos de l’elit politicoempresarial, moviment que convergí en l’anomenada Revolució Taronja que l’any 2004 pujà al poder arran de la denúncia de frau en les eleccions generals contra el candidat oficialista Viktor Janukovyč.
Primera ministra (febrer-setembre del 2005), mantingué una dura rivalitat amb el president i teòric aliat Juščenko, i posteriorment, al capdavant de la seva pròpia formació, fou elegida diputada en les eleccions del març del 2006. El desembre del 2007 fou elegida novament primera ministra al capdavant d’una coalició de partits de centre prooccidentals. Derrotada en les eleccions presidencials del 2010 per Janukovyč, passà a l’oposició, però hom inicià contra ella diversos processos judicials per corrupció. Condemnada a set anys de presó per un delicte d’il·legalitat i apropiació indeguda en la contractació de proveïment de gas comès el 2009, l’abril del 2010 el Tribunal Europeu de Drets Humans qualificà d’arbitrària la seva detenció.
Empresonada des de l’octubre del 2011 i afectada de problemes de salut, protestà pel tracte que rebia amb una vaga de fam (2012). L’octubre del 2013 la Unió Europea n’exigí l’alliberament com a condició per a la signatura d’un acord de lliure comerç amb Ucraïna. Després de la revolta d’Euromaidan i la fuga de Janukovyč, Tymošenko fou alliberada (febrer del 2014). Candidata a les eleccions presidencials del maig del 2014, fou derrotada per Petro Porošenko .