Graduat en dret el 1998 a la Universitat de la Fraternitat dels Pobles, posteriorment cursà estudis d’economia a la Universitat de Finances de Rússia, i el 2010, durant un semestre a la Universitat de Yale (EUA). Dedicat professionalment a l’assessorament financer, l’any 2000 ingressà al partit opositor liberal Jabloko, i a partir del 2002 en dirigí la branca moscovita.
Expulsat de Jabloko per donar suport a la ultranacionalista Marxa sobre Moscou (2006), l’any 2008 començà a denunciar la corrupció governamental a través del seu blog i també de Twitter. L’ús de les noves tecnologies i el llenguatge directe el feren molt popular a les grans ciutats, sobretot entre els joves. En ocasió de les eleccions parlamentàries del desembre del 2011, qualificà Rússia Unida, el partit del president Putin, de “banda de lladres i estafadors”, i organitzà manifestacions massives en contra dels resultats electorals, que considerava manipulats. L’any 2011 creà la Fundació Anticorrupció, destinada a investigar casos de corrupció a Rússia.
Empresonat dues setmanes, continuà les crítiques en ocasió de les eleccions presidencials del març del 2012, per la qual cosa fou multat i el seu domicili escorcollat. L’octubre del 2012 fou escollit en una votació lliure i oberta el primer líder de l’oposició russa. Acusat d’apropiació de béns públics a través de les seves activitats d’assessorament, el juliol del 2013 fou jutjat i sentenciat a cinc anys de presó, però al cap d’un dia se’l declarà en llibertat sota fiança.
Candidat a les eleccions del setembre del 2013 a l’alcaldia de Moscou, n’aconseguí el segon lloc i impugnà la victòria del candidat oficialista. Els processos a què fou sotmès comportaren crítiques a Rússia dels governs occidentals per irregulars i per estar políticament motivats. El 2016 el Tribunal Suprem li aixecà la sentència després que el Tribunal Europeu de Drets Humans (TEDH) dictaminés que hi va haver irregularitats en el judici. Processat per segona vegada, el febrer del 2017 un tribunal el declarà culpable amb càrrecs similars, sentència que impedia, de fet, que es pogués presentar com a candidat a les eleccions presidencials del 2018, a les quals havia declarat la intenció de concórrer. L’octubre del 2017 el TEDH tornà a criticar les sentències per arbitràries i parcials.
Al llarg del 2018 encapçalà les protestes i les crides al boicot contra les eleccions presidencials i, per aquest motiu, fou detingut i empresonat durant un mes i tres setmanes. Un cop alliberat, prosseguí les campanyes de mobilitzacions contra les autoritats en ocasió de noves cites electorals, durant les quals fou detingut. A causa d’una intoxicació que l’afectà la pell i la visió fou hospitalitzat i novament arrestat (juliol-agost del 2019). Continuà malgrat tot amb l’activitat antigovernamental i denunciant casos de corrupció, però el 2020 hagué de dissoldre la Fundació Anticorrupció quan el tribunal sentencià a favor d’un denunciat que l’havia demandat. A l’agost caigué malalt durant un vol a Sibèria i arribà a un estat crític de salut. Evacuat a l’hospital Charité de Berlín, d’on fou donat d’alta al setembre, els metges diagnosticaren intoxicació per l’agent nerviós novitxok. Poc després el govern alemany declarà que Naval’nyj havia estat emmetzinat. Al desembre, una investigació de mitjans de comunicació occidentals identificà agents del Servei de Seguretat Federal de Rússia com a presumptes autors materials de l’enverinament.
El 17 de gener de 2021 retornà a Rússia procedent de Berlín i fou detingut per les autoritats russes al control de passaports i posteriorment empresonat en un camp de treball de l’oblast’ de Vladimir, des d’on denuncià repetidament patir tortures. El març del 2022 fou condemnat a nou anys de presó per estafa a gran escala i desacatament judicial, que se sumaren a la pena de dos anys de presó que complia per violar la llibertat condicional i haver desviat fons provinents de donacions a la seva organització de lluita contra la corrupció. Empresonat per tal de complir trenta anys de presó per diferents condemnes al penal IK-6 (Vladimir), a uns 200 km de Moscou, el desembre del 2023 fou traslladat a la presó de K-3 de l’Okrug Autònom dels Iamal i dels Nentsi, una colònia penal situada a l’Àrtic, a 2.000 km de la capital, on morí per causes desconegudes.