Filla i deixebla del pintor Orazio Gentileschi, seguidor de Caravaggio. L’obra d’Artemisia és considerada un dels principals exponents del caravaggisme. Deixebla també del paisatgista Agostino Tassi, fou violada per aquest. Durant el judici a Tassi per ofensa a l’honor familiar —pel qual fou condemnat a ser expulsat de Roma—, Artemisa fou també sotmesa a judici (1612), durant el qual fou torturada per a verificar el seu testimoni. Un mes després del judici, es casà amb el pintor florentí Pierantonio Stiattesi, amb qui tingué quatre fills.
La seva primera pintura coneguda fou Susanna i els vells (1610), durant molt de temps atribuïda al seu pare. Sobresurten també dues versions de Judit decapitant Holofernes (1613 i 1620), considerades la culminació de la seva obra i interpretades com una venjança per la seva violació.
Des del 1614 residí a Florència, on fou la primera dona membre de l’Acadèmia de les Arts (1616) i treballà per als Medici, i on desenvolupà el seu estil amb obres com Al·legoria de la inclinació (1615), per als frescos de la Casa Buonarotti. Posteriorment passà a Roma (1620-27), Venècia (1627-30) i Londres (1638), on treballà amb el seu pare per a la cort de Carles I. Vers el 1630 s’establí a Nàpols i hi visqué fins a la mort.
Excel·lí sobretot en escenes mitològiques i bíbliques, en les quals combinà amb una gran habilitat realisme i dramatisme i el tenebrisme heretat de Caravaggio. Altres obres destacades són Ester davant d’Assuer (c. 1630) i els autoretrats com a Tocadora de llaüt, com a Al·legoria de la pintura (c. 1639) i com a Santa Caterina d’Alexandria (c. 1616).