El 1495 fou concertat el seu matrimoni amb l’arxiduc Felip d’Àustria, hereu de l’emperador Maximilià I i de Maria de Borgonya, i el 1496 es casà a Valladolid, per poders, i a Lilla, en persona. Per mort dels seus germans, els prínceps Joan i Isabel, i del fill d’aquesta, el príncep Miquel de Portugal, es convertí (1500) en hereva de la doble corona. El 1502, havent tornat dels Països Baixos, amb el seu marit foren jurats, a Toledo, prínceps d’Astúries, i ella sola, a Saragossa i a Barcelona (1503), princesa de Girona, amb la condició que si el seu pare tenia un fill masculí seria ell l’hereu.
En morir la seva mare (1504) fou aclamada per reina de Castella i fou jurada, amb el seu marit, a les corts de Toro, on el seu pare, que era governador del regne per disposició de la reina Isabel I, declarà la seva incapacitat per al govern. Per la concòrdia de Salamanca (1505) hom convingué que regnarien plegats Joana, Felip i Ferran, i per la concòrdia de Villafáfila (1506) fou declarada la incapacitat de Joana per a regnar, i romangué com a únic rei Felip (Felip I de Castella); Ferran, protestant-ho, es retirà als seus regnes. La mort del seu marit (1506) afectà granment el seu equilibri psíquic. Els partidaris del seu pare el cridaren de nou com a administrador del regne castellà, i el rei Enric VII d’Anglaterra la demanà en matrimoni, però morí al cap de poc. Joana es retirà, el 1509, a Tordesillas, i ja no se'n mogué.
Mort el seu pare (1516), heretà les corones de Castella-Lleó, Catalunya-Aragó i Nàpols-Sicília, el govern efectiu de les quals passà al seu fill Carles, el qual hagué de jurar, tant a les corts de Castella com a les de Saragossa i de Barcelona (1519), també a nom d’ella; fins a la seva mort el seu nom precedí el del fill en la documentació oficial solemne. En produir-se la revolta de les Comunitats de Castella, els comuners la reconegueren com a única reina, i llurs contraris no aconseguiren d’ella que signés provisions contra ells. En entrar els comuners a Tordesillas (1520) tampoc no aconseguiren cap document d’ella. Instrument de la política del seu pare i del seu marit, i fins i tot del seu fill, morí assistida per Francesc de Borja, duc de Gandia. És soterrada a la Capilla Real de Granada.