El 1552 fou casada amb el seu cosí germà el príncep hereu Joan de Portugal, fill de Joan III. Vídua el 1554, tornà a Castella i fou nomenada lloctinent general de les corones de Catalunya-Aragó i Castella-Lleó durant l’absència del seu pare i del seu germà Felip (1554-59), i donà minucioses instruccions al lloctinent de Catalunya García Álvarez de Toledo. Fou també consellera i amiga de les reines Isabel de França i Anna d’Àustria, cunyades seves.
D’una gran i severa religiositat, fundà, aconsellada per Francesc de Borja, duc de Gandia, el convent de Las Descalzas Reales, a Madrid, on fou soterrada.