Es casà el 1536, amb Alessandro de Mèdici, duc de Florència, i, en segones noces (1539), amb Octavi Farnese (Octavi I de Parma), motiu pel qual és sovint anomenada Margarida de Parma.
Escollida pel seu germà Felip II com a governadora dels Països Baixos (1559-67), cercà la col·laboració dels elements moderats de la noblesa flamenca, a través del consell d’estat, i sovint es féu portaveu de les seves aspiracions davant el sobirà. La pressió dels elements radicals sobre els caps moderats (Orange, Egmont, Horn) accentuà les reivindicacions autonomistes i religioses d’aquests, a les quals Felip II, per indicació de Margarida, respongué amb la destitució (1564) del conseller cardenal de Granvelle, mantenidor d’una política d’intransigència i de vinculació a Madrid. La monarquia, però, no volgué cedir en el terreny religiós —implantació dels decrets tridentins—, actitud que provocà avalots populars i acabà d’unir les diverses faccions de la noblesa flamenca entorn d’uns mateixos objectius (pacte de Breda, 1566). En optar per enviar al país un exèrcit reial comandat pel duc d’Alba, Felip II desautoritzà la política contemporitzadora de Margarida, que dimití (1567) i es retirà a Nàpols.