De nom de soltera Virginia Eshelman, adoptà el cognom del seu primer marit. Cursà estudis de música i de sociologia, que no acabà.
L’any 1957, mentre treballava com a ajudant de recerca al departament d’obstetrícia i ginecologia de la Universitat George Washington de Sant Louis, conegué William Masters, amb el qual es casà i dugué a terme estudis sobre la sexualitat humana, recollits a Human Sexual Response (1966) i Human Sexual Inadequacy (1970), de gran repercussió.
El 1964 el matrimoni creà a Saint Louis la Reproductive Biology Research Foundation, que el 1978 canvià la denominació per Masters and Johnson Institute.