Estudià violí, però s’interessà per la guitarra després de sentir John Lee Hooker. En la seva joventut treballà en oficis diversos i fou músic de carrer. El 1955 enregistrà el seu primer single, les cançons del qual, Bo Diddley i I’m a Man, foren un èxit popular. Des d’aleshores, al capdavant dels seus grups, desenvolupà un estil propi amb el qual, en l’estil del rhythm-and-blues, es convertí en un precursor del rock-and-roll juntament amb John Lee Hooker, Little Richard, B.B. King i d’altres que influïren Elvis Presley, The Rolling Stones, The Beatles i moltes altres figures del pop-rock, amb els quals col·laborà sovint.
Fou un dels primers músics que experimentaren amb la distorsió, la vibració i els ecos. Inventà un ritme propi (el “Bo Diddley beat”, un ritme de rock sincopat) molt estès en aquests gèneres de música. A més de la guitarra (que des del final dels anys cinquanta es feu fabricar expressament de forma rectangular) tocava també el violí, diversos instruments de teclat i la bateria. En els concerts adoptava una actitud descarada i divertida, i Jerome Green l’acompanyava amb unes maraques.
Entre d’altres, publicà els àlbums Bo Diddley is a Gunslinger, Have Guitar, Will Travel, ambdós del 1960, Two Great Guitars, amb C. Berry (1964), Another Dimension (1971) i A Man Amongst Men (1996). El 1998 li fou atorgat un premi Grammy honorífic.