Fou jugador del River Plate (1945-49), amb el qual guanyà dues Lligues de l’Argentina (1945 i 1947), i del Millonarios de Bogotà (1949-53), amb el qual guanyà quatre Lligues colombianes, llevat de la del 1950. Jugà cedit un any a l’Huracán (1946). El 1953 Josep Samitier n’impulsà la contractació pel Futbol Club Barcelona després d’arribar a un acord amb el River Plate, club que tenia els drets legals sobre el jugador. Paral·lelament, el Real Madrid negocià amb el Millonarios, l’equip en què jugava Di Stéfano en aquell moment. Una estranya maniobra federativa amb aval franquista resolgué que Di Stéfano jugués alternativament una temporada a cada club. En desacord amb el veredicte, el Barça renuncià al jugador.
Fou el líder del Real Madrid durant onze temporades (1953-64) guanyà la Lliga espanyola dels anys 1954-55, 1957-58 i 1961-64, una Copa (1962) i cinc Copes d’Europa (1956-60). Posteriorment fitxà pel RCD Espanyol, on jugà 47 partits en dues temporades (1964-66). Fou internacional en sis ocasions amb la selecció de l’Argentina, amb la qual guanyà la Copa Amèrica (1947), i també amb la de Colòmbia, en quatre ocasions, i des del 1956 formà part de la selecció espanyola, amb la qual jugà 31 partits. Posteriorment fou entrenador del Boca Juniors argentí, amb el qual guanyà la Lliga i la Copa el 1969, i la Lliga el 1981, el València (Lliga 1971) i el Real Madrid. Obtingué nombrosos trofeus individuals, entre d’altres, dues Pilotes d’Or (1957, 1959). L’any 2000 fou nomenat president honorari del Real Madrid.
Protagonitzà les pel·lícules Once pares de botas (1954), de Francesc Rovira; Saeta Rubia (1956), de Xavier Setó, i La batalla del domingo (1962), de Lluís Marquina.