Fou el tercer de sis germans, fill d’un petit comerciant de queviures, el qual era fill d’un serf de la gleva. Per influència del germà gran començà a publicar contes i articles, humorístics i satírics. El 1879 es traslladà a Moscou per ingressar a la facultat de medicina.
El 1881 començà a publicar els seus contes en periòdics. El volum P'ostrye Rasskazy (‘Contes de tots colors’, 1886) cridà l’atenció del novel·lista Dimitri V.Grigorovič, que l’encoratjà. Abandonà els pseudònims anteriors (Antǒsa Čekhonte, Un home sense esplín, El germà del meu germà), i la seva fama aviat es difongué.
Temptat pel teatre, escenificà contes propis, i, després d’un primer intent ja ambiciós, Platonov (1880-81), escriví el drama Ivanov (1887), que fou estrenat amb gran èxit. Amb les seves obres cabdals, Čajka (‘La gavina’, 1896), D’ad’a Van'a (‘L’Oncle Vània’, 1897), Try s’ostry (‘Les tres germanes’, 1901) Višn'ovyj sad (‘L’hort dels cirerers’, 1903), així com amb peces breus com Medved’ (‘L’ós’, 1888), Predloženije (‘El prometatge’, 1889), etc., donà un tomb decisiu al teatre europeu, ajudat en part per les escenificacions de Stanislavskij i Nemirovič-Dančenko.
Čekhov creà un teatre “d’estats d’ànim”, renuncià a l’acció dramàtica pròpiament dita i es detingué en la pintura d’atmosferes. Els personatges viuen, passivament o amb angoixa i insatisfacció sordes, la decadència de la societat de la Rússia tsarista. El seu destí es resol a llur entorn sense que hi puguin fer res, alhora que entreveuen l’apropament d’un món millor. Publicà un nou volum de contes, V sumerkakh (‘En el capvespre’, 1887), que li féu guanyar el premi Puškin de l’Acadèmia de Ciències. Conegué l’escriptora Lídia Avilov, que era casada, i se n'enamorà. Féu un viatge a l’illa de Sakhalin (1895), on dugué a terme una investigació sobre la situació dels deportats i reuní 10 000 fitxes de dades personals i de fotografies, avui encara conservades. Minada la salut per la tuberculosi, viatjà per l’estranger, es dedicà filantròpicament a la medicina i creà escoles per a infants camperols. Durant aquests anys escriví alguns dels seus millors contes.
Nomenat un dels primers membres de la secció de lletres de l’Acadèmia Russa de Ciències (1900), renuncià el càrrec quan el tsar vetà el nomenament de Gor'kij. El 1901 es casà amb l’actriu Olga L. Knipper, que havia conegut el 1892. La tuberculosi posà fi a la seva vida quan es trobava en un balneari alemany.