A Basilea (1515) freqüentà el cercle humanista i il·lustrà llibres per a l’impressor J. Froben. D’aquests anys són els retrats del burgmestre Mayer i de la seva muller (1516; Kunstmuseum, Basilea). El 1519 formà part del gremi de pintors de Basilea: retrat de B. Amerbach (1519), Crist al sepulcre (1521; Kunstmuseum, Basilea), retrat d’Erasme (1523; Musée du Louvre) i Mare de Déu de la família Meyer (1526; Schlossmuseum, Darmstadt). A causa de la reforma anà a Anglaterra (1526), recomanat per Erasme a Thomas More. El 1528 tornà a Basilea (retrat de la seva família; Kunstmuseum de Basilea), i el 1532 s’establí definitivament a Anglaterra, on fou pintor d’Enric VIII: Els Ambaixadors (1533; National Gallery, Londres), Joana Seymour (Kunsthistorisches Museum, Viena), Enric VIII (Galleria Nazionale d’Arte Antica, Roma), El Duc de Norfolk (1538; Windsor Castle), Anna de Clèves (Musée du Louvre), Caterina Howard (Toledo Museum, Ohio). Estigué plenament identificat amb l’esperit humanista gràcies a la relació que mantingué amb el grup d’Erasme i de Thomas More. Retratista extraordinari, mitjançant un dibuix precís i minuciós copsà els trets més característics de la personalitat dels seus models.
El seu pare i mestre fou Hans Holbein el Vell (Augsburg 1465 — Isenheim 1524). Entre les seves obres —d’arrel encara gòtica, però amb evident influència del Renaixement italià— es destaquen el retaule per a l’església dels dominics de Frankfurt (1500-01), alguns retrats i nombrosos dibuixos.