Es graduà de mestre en arts a París. Aristotèlic en sentit humanista, anà a Itàlia, on el 1492 tractà amb Ermolao Barbaro i amb el platònic Pico della Mirandola. Amb aquest, i amb els occamistes, tingué en comú l’interès per les matemàtiques i l’astronomia.
Home de vida integèrrima, la seva afecció pels místics l’emmenà a editar, entre altres, les obres del pseudo-Dionís (1498) i de Nicolau de Cusa (1514), així com les de R. Llull: el Liber contemplationis, que coneixia, sembla, des del 1491, el Liber de laudibus b. Mariae, el Clericus, el Phantasticus i el Liber natalis (1499). El 1500 copià d’altres escrits lul·lians a Pàdua. El 1505 estampava a París, amb una endreça a Alfons d’Aragó (fill de Ferran II), una part del Liber contemplationis i el De amigo et amato. Entre els seus deixebles al col·legi Lemoine de París —ultra G. Briçonnet, G. Farel i els Amerbach— figuren els lul·listes C. Bouelles, Josse Clichtove i Beatus Rhenanus.
El temps que s’estigué a Saint-Germain-des-Prés, prop de l’abat Briçonnet (1507), publicà encara els Proverbia i l'Arbor philosophiae amoris, de Llull (1516). Però des d’aleshores es consagrà amb preferència als estudis bíblics. Amb les Epístoles de Pau (1516) inicià les edicions comentades de l’Escriptura —tot donant-ne la vulgata i una nova traducció directa del grec— i els seus tractats de crítica neotestamentària, els uns i els altres rebuts amb suspicàcies pels teòlegs parisencs més tradicionals, com Noël Beda.
Nomenat Briçonnet bisbe de Meaux (1516), el seguí l’any 1520 com a vicari general. Allà preparà la traducció francesa del Nou Testament (1523) i dels Salms (1525). Suspecte de luteranisme el grup de Meaux, el 1525 Lefèvre es refugià a Estrasburg. L’any següent, el rei el cridà a Blois. En 1529-30, però, es cregué més segur a Nerac, feu dels Albret i residència de Margarida de Navarra, protectora dels reformats. Allà el visità Calví l’any 1534. Tot amb tot, Lefèvre, com Erasme, pertany més aviat al moviment reformista pretridentí dins l’Església Catòlica. La seva completa versió francesa de la Bíblia fou estampada a Anvers, el 1530, amb privilegi de Carles V.