Filla gran de l’emperador Carles V i d’Isabel de Portugal. Fou casada, a Valladolid (1548), amb el seu cosí germà l’arxiduc Maximilià, després emperador. Ambdós reberen el títol de reis de Bohèmia, i foren governadors per absència del príncep Felip, germà d’ella. Quan aquest tornà, el 1551, passaren a Alemanya. Admiradora del seu germà Felip II i catòlica fervent, ja vídua tornà a Madrid (1581), protegí els jesuïtes i ingressà —sense professar— al convent de Las Descalzas Reales, on és soterrada. Formaren part de la seva cort els germans Leonardo de Argensola i el músic Tomàs L.de Victoria.