Desenvolupà les tècniques d’impregnació argèntica amb una cinquantena de variants. L’aplicació d’alguns dels seus mètodes permeté la descripció de la micròglia i de quatre menes de cèl·lules d’oligodendròglia (glia neuròtropa) diferenciant-les de les cèl·lules de mesòglia, anomenades avui cèl·lules d’Hortega. Relacionat inicialment amb Ramón y Cajal i la seva escola, se n'allunyà per un seguit de discrepàncies amb el mestre. Exiliat a l’Argentina, fou nomenat director de l’Instituto Nacional del Cáncer a Buenos Aires (1931), on fundà la revista Archivos de histología normal y patológica.