Graduat en medicina a Rochester (1943), des del 1947 treballà a la facultat de Medicina de la Universitat de Washington de Saint Louis on, juntament amb la psicòloga i sociòloga Virginia E.Johnson, amb qui es casà, inicià les seves recerques sobre conducta i fisiologia sexual. El 1964 fundaren la Reproductive Biology Research Foundation, i el 1973 el Masters & Johnson Institute (clausurat el 1994, un any després del seu divorci). L’aportació d’ambdós en el camp de la sexologia és considerada pionera i fonamental. Publicaren diversos llibres que, malgrat el seu contingut tècnic, obtingueren un gran èxit entre el gran públic: en particular, Human Sexual Response (1966), sobre la conducta sexual humana, i Human Sexual Inadequacy (1970), sobre disfuncions sexuals, i també Homosexuality in Perspective, a Report on the Clinical Treatment of the Sexual Problems of Homosexuals (1979), Crisis: Heterosexual Behaviour in the Age of AIDS (1988) i Heterosexuality (1994).