Graduat en medicina per la Universitat de Michigan el 1883, practicà la medicina i la cirurgia a l’hospital St. Mary de Rochester amb el seu pare, William Worral Mayo (Manchester, Anglaterra 1819 - Rochester, Minnesota 1911), i germà, Charles Horace Mayo (Rochester, Minnesota 1865 - Chicago 1939), amb qui cofundà, l’any 1889, el que anys més tard, el 1903, fou la Clínica Mayo, un dels centres quirúrgics més reconeguts del món. William Mayo s’especialitzà en cirurgia de l’abdomen, la pelvis i el ronyó, i en operacions de càncer. El 1915, conjuntament amb el seu germà iniciaren un programa d’especialització per a estudiants graduats en medicina, i el 1919 crearen la Fundació Mayo.