Probablement feu els primers estudis musicals a la seva ciutat natal. Començà la seva trajectòria professional l’any 1557 com a cantor de la capella musical de la cort dels Habsburg a Praga i Viena, on es formà sota la direcció de Jacobus Vaet. Del 1568 al 1570 interrompé la seva estada per fer un viatge d’estudis a Itàlia. De retorn a Viena, continuà al servei de Maximilià II. Quan l’emperador morí, l’any 1576, el seu successor, Rodolf II, el mantingué en el càrrec i poc temps més tard fou promogut al lloc de vicemestre de capella de la cort. El 1582 era a Innsbruck al servei de l’arxiduc Ferran, i n’arribà a ser el mestre de capella. El 1596 retornà a Praga, on recuperà el seu antic lloc i restà fins a la data de la seva mort.
Escriví fonamentalment música de caràcter religiós. La major part de la seva producció és formada per misses i motets. També cultivà els gèneres profans, vessant en el qual arribà a ser molt popular. Les seves obres continuaren apareixent en antologies molts anys després de la seva mort. Se n’han conservat nombroses cançons a tres veus -com el volum Tricinia (1584)-, amb text alemany, en les quals s’entreveuen les característiques de l’estil italià. La col·lecció més important són els tres volums dels Teutsche Lieder, publicats primer com a llibres independents els anys 1576, 1577 i 1579 i agrupats després en un de sol, publicat a Munic el 1583. Fou considerat, juntament amb Roland de Lassus, un dels més brillants compositors francoflamencs de la seva generació. Moltes de les seves obres foren arranjades en tabulatures instrumentals fins a mitjan segle XVII.
Sacrae aliquot cantiones, quas motecta vulgus appellat, 5, 6 v. (publ. 1575); Aliquot cantiones, quas motecta vulgus appellata, ex veteri atque novo testamento collectae, 4 v. (publ. 1577); Mariale, hoc est, Opusculum sacrarum cantionum omnibus Beatissimae Virginis Mariae festivitatibus, 4, 6, 8 v. (publ. 1588); Missae sacrae ad imitationem selectissimarum cantionum suavissima harmonia, 5, 6, 8 v. (publ. 1588); Continuatio missarum sacrarum, ad imitationem selectissimarum cantionum suavissima harmonia, 4-6, 8, 10 v. (publ. 1602); Corollarium missarum sacrarum ad imitationem selectissimarum cantionum suavissima composi tarum (publ. 1603); Sacrarum cantionum, 4-8, 12 v. (publ. 1605); prop de 20 misses; més de 100 himnes, prop de 50 motets; Passió segons sant Mateu
Il primo libro delle canzone italiane, 5 v. (publ. 1574); Kurtzweilige teutsche Lieder su dreyen stimmen nach Art der Neapolitanen oder welschen Villanellen, 5 v. ('Divertides cançons alemanyes a tres veus a l’estil de les villanelle, napolitanes, o llatines', publ. 1576); Der ander Theyl kurtzweiliger teutscher Lieder, 3 v. ('Una altra part de cançons alemanyes divertides', publ. 1577); Der dritter Theyl schöner kurtzweiliger teutscher Lieder, 3 v. ('Tercera part de boniques cançons alemanyes divertides', publ. 1579); Newe kurtzweilige teutscher Lieder, 5 v. ('Noves cançons alemanyes divertides', publ. 1580); Il secundo libro delle canzone italiane, 5 v. (publ. 1581); Teutsche Lieder, 3 v. ('Cançons alemanyes', publ. 1583); Kurtzweilige teutsche Lieder, 4 v. ('Divertides cançons alemanyes', publ. 1591)
Lautenbuch... sampt ausserlesenen deudtschen und polnischen Tentzen, Passamezen, Gaillarden, deudtschen Vilanellen, Neapolitanen und Phantasien ('Llibre de cançons per a llaüt... juntament amb el llibre de danses alemanyes i poloneses, passamezze, gallardes, villanelle alemanyes, napolitanes i fantasies', publ. 1592); Der erste Theil newer lateinischer und deutscher Gesenge... nebenst nachfolgenden schönen Fantasien, Padouanen und Galliarden ('Primera part de noves cançons llatines i alemanyes... seguits de belles fantasies, pavanes i gallardes', publ. 1597)
- Pass, W.: Thematischer Katalog sämtlicher Werke Jacob Regnarts, Böhlau, Viena 1969
- Pass, W.: Jacobus de Regnart (c. 1540-1599): Opera omnia, Corpus Mensurabilis de Musica 62, 9 vols., American Institute of Musicology, Leawood 1972