Es formà amb els dominics i els jesuïtes, però hagué de seguir l’ofici del pare (propietari de dos molins) i entrà a la Corporació de forners. En morir aquest, Josef es dedicà a la música, que havia estudiat de petit, i es perfeccionà amb F.A. Habermann i J. Seger. El 1763 anà a Venècia a estudiar amb G.B. Pescetti, que l’orientà en la composició d’òperes. Dos anys després, amb motiu del casament de Josep II, estrenà a Parma Il Parnaso confuso. A la cerimònia hi havia l’ambaixador de Nàpols, el qual, encantat, li encarregà una altra òpera per a l’aniversari de Carles III d’Espanya. Myslivecek compongué aleshores Il Bellerofonte. De retorn a Praga (1768), de seguida adquirí tanta fama com a Itàlia, on s’havia guanyat l’epítet de divino boemo. El 1770 trobà per primera vegada W.A. Mozart, a Bolonya, i hi establí una afable relació que durà fins a la darrera visita del salzburguès a Munic, on Myslivecek, que hi havia presentat l’oratori Abramo e Isacco, estava malalt (1777). El 1771 esdevingué membre de l’Acadèmia Filharmònica de Bolonya i obtingué un gran èxit a Milà amb Il gran Tamerlano. El 1778 tornà a Nàpols i a Roma, on morí. Gran conreador de l'opera seria, que irradià des de Nàpols cap a tot Europa, mantingué la tradició del gènere a un alt nivell. Fou el més gran representant de l’òpera txeca del segle XVIII, però no en renovà les convencions i només amplià l’elaboració dels passatges virtuosístics i l’extensió dels ritornelli. En els oratoris i cantates trobà més llibertat formal i donà més variació i profunditat a l’ús orquestral. També deixà unes quantes simfonies, quartets, sonates i els notables sis Quintetti per archi.
Medea (1764); Il Bellerofonte (1767); Farnace (1767); Il trionfo di Clelia (1767); Demofoonte (1769); L’Ipermestra (1769); La Nitteti (1770); Montezuma (1771); Il gran Tamerlano (1771); Il Demetrio (1773); Erifile (1773); Romolo ed Ersilia (1773); La clemenza di Tito (1773); Antigona (1774); Atide (1774); Artaserse (1774); Demofoonte (1775); Ezio (1775); Merope (1775); Adriano in Siria (1776); Calliroe (1778); L’Olimpiade (1778); La Circe (1779); Il Demetrio (1779); Armida (1779); Medonte (1780); Antigono (1780)
Narciso al fonte, cantata (1768); La famiglia di Tobia, oratori (1769); Adamo ed Eva, oratori (1771); Giuseppe riconosciuto, oratori (1771); La passione di Gesù Cristo, oratori (1773); La liberazione d’Israele, oratori (1775), Isacco figura del Redentore, oratori (1776); Il tempio d’Eternità, cantata (1777)
Sinfonie a 4, orq. (publ. 1763); 6 sinfonie concertanti, orq. (publ. 1768); 6 sonates en trio (publ. 1768); 6 sonates, pno./clvd., vl. (publ. 1775); 6 overtures, orq. (publ. 1775); 6 Easy Divertimentos, pno./clvd. (publ. 1777); 4 concerts instr. teclat, més de 10 qt. c., 3 octets, 9 sonates instr. teclat