De família jueva benestant i d’un elevat nivell cultural, es graduà en medicina a la Universitat de Torí l’any 1936, però el 1938 es veié impedida d’exercir a causa de les prohibicions imposades als jueus per Mussolini en el camp professional. Com a alternativa, establí a casa seva un petit laboratori, on començà a estudiar el desenvolupament cel·lular en embrions de pollastre. Durant la Segona Guerra Mundial visqué en semiclandestinitat amb la seva família.
Al final del conflicte anà als EUA, on treballà a la Washington University, a Saint Louis, sota la direcció de Viktor Hamburger, on descobrí amb Stanley Cohen el factor de creixement nerviós (FCN), la proteïna que regula el creixement cel·lular. Posteriorment, descobriren el paper central en els trastorns neurològics, tant disfuncionals (càncer) com degeneratius (malaltia d’Alzheimer). Per aquest descobriment, Cohen i Levi-Montalcini compartiren el premi Nobel de medicina l’any 1986.
Desenvolupà la seva carrera científica i docent principalment a la Universitat de Washington, on fou professora associada (1956), i del 1958 al 1977, professora titular. Tanmateix, dividí la seva activitat entre els Estats Units i Itàlia, on l’any 1962 fou cofundadora de l’Institut de Biologia Cel·lular de Roma. Fou també directora del Centre Nacional de Neurobiologia del Consell Nacional per a la Recerca (1961-69) i, posteriorment, del Laboratori de Biologia Cel·lular (1969-78) i l’Institut de l’Enciclopèdia Italiana (1993-1998), tots ells organismes oficials. L’any 2001 fundà l’Institut Europeu de Recerca sobre el Cervell (EBRI: European Brain Research Institute), en el qual treballà fins poc abans de la seva mort.
Així mateix, assessorà empreses farmacèutiques, activitat que donà lloc a algunes polèmiques. Fou també rellevant la seva activitat pública en campanyes a favor de causes diverses, com ara l’educació o el medi ambient, i fou cofundadora de la Fundació Rita Levi-Montalcini (1992), dedicada al primer d’aquests camps, i de la secció italiana de la Creu Verda Internacional (1998), al segon.
Identificada amb el centreesquerra, l’any 2001 fou nomenada senadora vitalícia. A banda de les nombroses publicacions en el camp científic, és autora de llibres de divulgació d’aquest àmbit que aconseguiren un notable ressò: Il tuo futuro (1993), Senz’olio contro vento (1996), L’asso nella manica a brandelli (1998), La galassia mente (1999), a més de les memòries Elogio dell’imperfezione (1987).
A més del premi Nobel, obtingué altres distincions, com ara el premi Max Weinstein a la recerca neurològica (1963), el premi Albert Lasker de recerca mèdica bàsica (1983), la National Medal of Science dels Estats Units (1987), diversos doctorats honoris causa i condecoracions oficials de la República Italiana. Fou també membre de l’Acadèmia Nacional de les Ciències dels Estats Units (1968), de l’Acadèmia Pontifícia de Ciències (1974), malgrat el seu ateisme (fou la primera dona a ocupar-hi una plaça) i de la Royal Society (1995), entre d’altres.