Bé que la successió no li corresponia (l’hereva era Joana de Castella, dita la Beltraneja, filla del seu germà Enric IV de Castella), fou utilitzada durant la guerra civil per un dels bàndols nobiliaris, el qual aconseguí, mort el seu germà Alfons (1468), que fos proclamada hereva (concòrdia de Guisando). El seu matrimoni (1469) amb el futur Ferran II de Catalunya-Aragó obrí noves perspectives a la seva ambició política i significà un sosteniment important en la lluita pel tron castellà.
Enric IV, però, molestat, legitimà i reconegué Joana i desheretà Isabel (1470); però, en morir ell el 1474, un sector de la noblesa proclamà Isabel, a Segòvia, reina de Castella, mentre que Joana, sostinguda per Alfons V de Portugal i un sector important del país, també ho fou, el 1475. La guerra civil, decantada sensiblement a favor d’Isabel des de la batalla de Toro (1476), no s’acabà de fet fins a la pau amb Portugal (1479). Amb el sosteniment del seu marit, rei de Catalunya-Aragó des del 1479, reduí amb duresa tots els sectors hostils de la noblesa castellana, andalusa i gallega i pogué empènyer la conquesta del regne nassarita de Granada (1481-92), que posà fi a la Reconquesta. Inicià també una política de prestigi de la monarquia —abolició dels privilegis lliurats per Enric IV a la noblesa (1480) i incorporació a la corona del govern de l’orde de Calatrava (1847)— i acomplí una pregona reforma administrativa —estructuració del consell reial, política selectiva dels funcionaris, creació del nou consell de la Santa Hermandad (1476), encarregat de mantenir l’ordre públic, i millora en el govern dels municipis i en l’administració de justícia—.
En l’aspecte econòmic, reforçà les finances públiques, mitjançant una més dura i racional política impositiva, així com els diversos sectors econòmics del país. Quant a la política religiosa, afavorí una notable reforma, orientada a la fiscalització per part de la corona dels recursos del sector eclesiàstic i a la reestructuració de la vida disciplinària dels convents, els monestirs i clergat secular; d’altra banda, la creació de la nova inquisició (1478) i del Consell de la Suprema i General Inquisició (1483), així com l’expulsió dels jueus (1492) i dels mudèjars (1502), palesaren un esperit intransigent, que tingué una influència negativa en la política i en l’economia castellanes.
La seva política exterior fou en gran part orientada pel seu marit, i, bé que la seva intervenció en l’empresa del descobriment d’Amèrica (1492) (Cristòfor Colom) no fou gaire important, en incorporar el Nou Món en exclusiva a Castella palesà el seu escàs interès en els afers de Catalunya-Aragó. La seva poca simpatia pels catalans s’evidencià, així mateix, en sostenir que valia més reduir-los per les armes que patir l’arrogància de llurs corts i en recomanar al seu sogre, Joan II de Catalunya-Aragó, acabada la guerra civil (1472), que prengués venjança i que no fos magnànim amb els vençuts.