Fou catedràtic de zoologia de la Universitat de Madrid. Publicà uns Elementos de Zoología (1861), que foren reeditats sovint, i Insectos nuevos o poco conocidos de la fauna española.

Participà en diversos viatges per l’hemisferi austral i recollí més de 100 000 mostres, entre les quals aportà més de 2 500 espècies noves d’animals. Publicà nombrosos treballs que foren utilitzats més tard per Darwin.

En col·laboració amb el seu germà Remy, escriví un vast Traité de Zoologie, en sis volums (1893-99), que ha estat un text bàsic a França durant quasi mig segle. Com a filòsof de la natura, seguí les petjades de Lamarck i s’oposà, així, als darwinistes.

Fou professor de botànica a Marburg, Bonn, Basilea i Tübingen. S'especialitzà en embriologia i fisiologia vegetals. Estudià i mesurà les pressions osmòtiques de les solucions aquoses, mitjançant unes membranes semipermeables, que són conegudes com a cèl·lules de Pfeffer. Publicà Handbuch der Pflanzenphysiologie (1881) i Studien zur Energetik der Pflanze (1892), entre altres obres.

Estudià a Berlín; fou deixeble de Koch i més tard professor a Königsberg (1899) i Breslau (1909-25). Descobrí les endotoxines i el fenomen de la bacteriòlisi in vivo, conegut amb el seu nom. Posà en pràctica nous mètodes d’immunització i ha donat nom a un bacil que ell considerà erròniament com el productor de la grip.

Continuador de l’obra de J. Müller, ensenyà fisiologia a Bonn i fundà la revista científica Archiv für die gesammte Physiologie. Es destacà sobretot pels seus estudis sobre els reflexos espinals, el mecanisme de la termoregulació, els aspectes químics de l’activitat cardíaca, el quocient respiratori i el desenvolupament de l’embrió (cordons de Pflüger, formats amb cèl·lules d’epiteli germinatiu).

Estudià especialment la regulació endocrina del cicle menstrual femení i presentà la primera píndola contraceptiva oral (1956). Publicà, entre d’altres, The Control of Fertility (1965).

Investigà els processos físics de la circulació sanguínia mitjançant aparells de la seva invenció, com l’hemodinamòmetre i el viscosímetre. L’any 1840 formulà la llei que relaciona la velocitat mitjana d’un líquid a l’interior d’un tub capil·lar amb l’àrea de secció del tub, la pressió i la viscositat.