Fill d’emigrants jueus russos, l’any 1941 es graduà en química a la Universitat de Miami. Durant la Segona Guerra Mundial supervisà la instal·lació elèctrica d’una fàbrica d’armament a Memphis i el proveïment d’aigua dels establiments on s’allotjaven els pilots de guerra a Miami Beach. Rebutjada la seva sol·licitud d’estudiar a la Universitat de Yale, l’any 1949 obtingué el doctorat en química a la Universitat de Columbia. Posteriorment fou professor a la universitat Western Reserve de Cleveland fins el 1953, any que s’incorporà al departament de farmacologia de Yale, on desenvolupà tota la seva carrera científica.
La seva aportació principal se centra en els estudis sobre la timidina, nucleòsid de l'ADN a partir del qual creà dos importants agents antivírics: el primer, la idoxuridina (vers el 1950), que es mostrà efectiva en el tractament de la queratitis infantil i fou el primer fàrmac antivíric aprovat pel Food and Drug Administration. El segon, l’estavudina, o d4T, relacionada amb l'AZT, sintetitzada el 1960 per Jerome Horwitz, fou aplicada per Prusoff i el seu equip al virus de la sida, inhibint la replicació del VIH, malgrat els efectes secundaris de considerable gravetat. Aquest fàrmac fou comercialitzat a partir del 1994 amb el nom de Zerit. Gràcies als ingressos de les seves patents inicià una campanya sobre les companyies farmacèutiques per a reduir-ne el preu a l’Àfrica subsahariana, cosa que aconseguí l’any 2001. Aquest any creà també la William H. Prusoff Foundation, dedicada a causes socials i a programes interdisciplinaris d’estudi de l’antisemitisme, vinculats a la Universitat de Yale.